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TA克隆出现假阳性的原因有哪些?
首先，你的假阳性的定义是什么呢？是板上长了菌落，而且是白色的，但是里面没有插入片段的意思吗？以下是在这个定义基础上进行的讨论。
第一， TA克隆的自身环化是造成这种现象的最主要原因，根据我的经验，不同公司提供的TA载体的自身环化率在20%到50%之间。这个比例可以通过优化连接反应的条件进行改善。无非就是提高反应体系中目的基因片段的含量，通常DNA:TA载体大概应在1：3左右，加入更多片段可以显著提高链接的效率。再就是提高DNA片段的纯度，减少其中的杂质，这需要通过改进DNA凝胶纯化的方法来实现。QIAGEN的凝胶纯化试剂盒非常好。常量高纯度也好。
第二， 除了自身环化之外就是在PCR产物不纯，里面还有引物等小片段，这些东西更容易与TA载体链接，最后进行酶切鉴定时又看不到插入片段。这一般不容易发生，有的人喜欢用柱子纯化PCR产物，我则习惯跑胶后纯化，这样PCR产物和引物等已经完全分离，则不会发生这种情况。
第一点是最主要的，改善链接反应后可以将假阳性的比例降至极低，前段时间我克隆了10个基因，每板挑取4个克隆，其中8个基因的片段插入率都能达到100%。另2两也能达到75%。选用高质量的TA和凝胶纯化试剂盒是关键。推荐QIAGEN的凝胶纯化和PROMEGA的TA克隆。
什么是T-克隆载体和U-克隆载体？
在PCR反应中，emphasis：role=italicTaqemphasis酶通常会在延伸的PCR产物3′末端加上一个非配对的碱基A。根据这一特性研制出了一种线性质粒，其5′端各带一个不配对的碱基T。采用这样的质粒可将PCR产物以TA配对连接的方式直接进行克隆，即TA克隆。
用于TA克隆的载体被称为T-克隆载体，它的出现使PCR产物的克隆更加简便快捷。如pGEM-3Z4Z载体由pUC1819增加了一些功能片段改造而来，大小为2.74kb。与pUC1819相比，在多克隆位点的两端添加了噬菌体的转录启动子，如Sp6和T7噬菌体的启动子（link：xlinkhref=i010801图4-8link），便于克隆片段的测序。pGEM-3Z和pGEM-4Z的差别在于二者互换了两个启动子的位置。
脱氧胸腺嘧啶核苷（T）容易与其他碱基发生非特异性配对，而且T-克隆载体也容易同反应系统中残留的引物或不完整的PCR扩增片段连接。相比之下，UA配对具有更高的特异性。因此研制出一种5′端带一个不配对碱基U的线性质粒，即U-克隆载体。
TA克隆的反应条件
可以用末端转移酶来完成加T反应，这种方法一般称为加T/A法克隆。